含纳米银材料银离子释放量的测定 滤膜法

前   言  

　　本标准参考GB/T 1.1-2009标准编写。

　　请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。

　　本标准由中国科学院提出。

　　本标准由全国纳米技术标准化技术委员会（SAC/TC279）归口。

　　本标准负责起草单位：国家纳米科学中心。

　　本标准参与起草单位：中国食品药品检定研究院。

　　本标准主要起草人：谢黎明、黄河、刘颖、吴美玉、李瑞如。

引   言

　　纳米银以其广谱的抗菌性能在生活用品、医疗器械及生物医药等诸多领域中得以广泛应用。随着纳米银产品的不断发展与广泛使用，其生物安全性引起了人们的高度关注。纳米银产生的生物学效应与其释放的银离子（Ag+）浓度有密切关系。释放的Ag+能干扰细胞的呼吸链，使胞内的活性氧物种浓度增加，从而影响细胞的正常功能而产生细胞毒性作用。因此银离子释放量是纳米银材料的生物学安全效应的重要参考数据。目前尚无测定纳米银材料银离子释放量的国家标准颁布。本标准采用滤膜离心法分离纳米银材料释放的银离子，然后使用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS)测定Ag+的释放量。

含纳米银材料银离子释放量的测定 滤膜法（国家标准已报批）

Determination of Silver Ion Release from Silver Nanomaterials Filtration Method

　　1 范围

　　本标准规定了纳米银材料（包括涂层、固体或溶液）银离子释放量测定方法，包括样品制备和测量方法。

　　本标准方法的银释放量测定下限为：涂层xxx μg/g，固体 xxx μg/g，溶液 xxx μg/g。　

　　2 规范性引用文件

　　下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注明日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

　　GB/T 19619 纳米材料术语

　　HJ700水质65种元素的测定电感耦合等离子体质谱法

　　YY/T 1447-2016外科植入 物植入材料磷灰石形成能力的体外评估

　　3 术语和定义

　　3.1 银纳米材料 Silver nanomaterials

　　指三维空间尺度至少有一维处于纳米量级（1-10nm）的金属单质银材料，其可存在于粉末、溶液、表面涂层等样品中。

　　3.2 模拟体液 Simulated Body Fluid（SBF）

　　一种与人体血浆组成相似而不含有机成分的无机溶液。

　　4 方法原理

　　纳米银容易被氧化，在液体介质（如磷酸盐缓冲液、模拟体液）中能释放出Ag+，通过选择合适孔径的滤膜进行离心过滤可分离出释放的银离子[1-3]，然后采用电感耦合等离子体质谱仪测定银浓度，从而获得银离子释放量。

　　电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）是以等离子体为离子源的一种质谱型元素分析方法，适用于痕量到微量重金属元素的分析，其测量过程包括：样品由载气引入雾化系统进行雾化后，然后以气溶胶形式进入等离子体中心区，在高温和惰性气氛中被去溶剂化、汽化解离和电离，转化成带正电荷的正离子，转化成带正电荷的正离子，经离子采集系统进入质谱仪，质谱仪根据质荷比进行分离，根据元素质谱峰强度测定样品中相应元素的含量。

　　5 仪器与试剂

　　5.1 仪器

　　5.1.1 电感耦合等离子体质谱分析仪。

　　5.1.2 分析天平，感量0.1mg。

　　5.1.3 离心机。

　　5.1.4 A级500mL玻璃量器。

　　5.1.5 一次性过滤膜分离器。

　　5.2 试剂

　　除非另有说明，在分析中仅使用确认为优级纯的试剂；所用水为去离子水，其电阻率不小于18.2 MΩ·cm.，符合GB/T 6682规定的一级水。

　　5.2.1 银溶液标准样品，1.0 mol/L 硝酸（购自北京有色金属研究院，有证书）

　　5.2.2 铟溶液标准样品，硝酸（购自美仑生物科技公司，有证书）

　　5.2.3 2%稀硝酸溶液

　　5.2.4 氩气（纯度≥99.99%）

　　5.2.5 模拟体液（SBF，购北京雷根生物技术有限公司，配方见附录A）

　　5.2.6 纳米银材料

　　6 样品制备

　　6.1 纳米银材料释放的银离子待测样品准备

　　6.1.1 剪取1cm×1cm纳米银涂层材料、准确称取10mg的纳米银固体以及准确移取200μL 1mg/mL的纳米银溶液各4份，分别加入50mL离心管中，每份再加入模拟体液分散介质20mL。

　　6.1.2 将样品放入摇床中，37℃下振荡，1、6、12、24h分别从4个样品管中取释放液2mL，用截留分子量为3kDa（4000g，30min）的超滤管离心过滤，滤膜用1mL对应的分散介质重复操作洗涤3次，取下层过滤液，容量瓶定容至5mL。若浓度超出ICP-MS的检测范围，需梯度稀释一定倍数，原液及稀释液待测。

　　6.2 ICP-MS标准样品准备

　　6.2.1 配制25μg/L铟溶液作为内标标准使用溶液。移取10μL 1mg/mL的铟标准溶液放入小离心管中，移取990μL 2%稀硝酸溶液定容到1mL。再将该稀释100倍的铟溶液取出125μL至50mL容量瓶中，定容至50mL备用。

　　6.2.2 配制银标准系列溶液。

　　6.2.2.1 将1mg/mL的银标准溶液分别逐级稀释到1000μg/L备用。

　　6.2.2.2 分别取6.2.2.1中1000μg/L的银溶液25μL、50μL、250μL、500μL、1000μL、2500μL稀释到50mL，用2%硝酸配制成0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的银标准系列溶液。

　　7 测量步骤

　　7.1 ICP-MS开机按照仪器操作规程执行。

　　7.2 将6.2.1中的铟内标标准使用溶液通过ICP-MS仪的内标管持续在线加入。

　　7.3 标准系列溶液测定

　　7.3.1 将6.2.2.2中配制的标准银溶液从浓度由低到高依次测量。

　　7.3.2 测量完毕后用2%稀硝酸溶液冲洗。

　　7.4 样品溶液测定

　　7.4.1 将6.1.2待测样品按浓度由低到高依次测量。

　　7.4.2 测量完毕用2%稀硝酸溶液冲洗。

　　7.5 将测量数据从计算机中导出，并按规定顺序关闭ICP-MS仪器和计算机。

　　7.6 按规定程序关机。　

　　8 数据分析

　　8.1 纳米银材料释放银离子的含量（μg/g）

　　9 精密度

　　在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算数平均值的30%。

                                                                         附录A

                                                                   （资料性附录）

                                                                 模拟体液概述及配方

      A1. 使用模拟体液规定的成分及浓度

                                           表A1 SBF和人体血浆的离子浓度

      A2. 使用模拟体液的配方

                        表A2 配制1L SBF添加试剂的顺序、质量、称量容器、纯度以及分子量

                                                                            附录B

                                                                     （资料性附录）

                                                     滤膜分离法对银离子回收率影响的测定

       B.1 滤膜分离法对银离子回收率影响的测定步骤

      （一）用于滤膜过滤的银标准溶液（相当于过滤后标准银离子溶液）制备如下

      （1）首先将1mg/mL（1000ppm）的银标准溶液用分散介质（超纯水或SBF）分别逐级稀释到100μg/L备用。（1000μg/mL→10μg/mL→0.1μg/mL）

     （2）分别取上述100μg/L的银溶液500μL、5000μL稀释到50mL，用分散介质配制成1μg/L、10μg/L的银标准系列溶液。另外，还准备100μg/L、1000μg/L、2000μg/L、5000μg/L、10000μg/L的银标准系列溶液。

      （3）取标准的不同浓度银离子溶液1μg/L、10μg/L、100μg/L、1000μg/L、2000μg/L、5000μg/L、10000μg/L，各3份，每份2mL，每一份用截留分子量为3kDa（4000g，30min，25℃）的超滤管离心过滤，先取出过滤液至容量瓶，滤膜再用1mL对应的分散介质重复操作洗涤2次，同样每操作一次都得同时取出下层过滤液至容量瓶（该过程不要更换枪头），最后用少量分散介质清洗一下滤过液管壁，取之至容量瓶，再用高于2%硝酸溶液进行容量瓶定容至5mL（最终尽量确保是2%的稀硝酸溶剂）。若浓度超出ICP-MS的检测范围（尽量保证上机浓度不要超过50μg/L），需梯度稀释一定倍数，原液及稀释液待测。

        （二）用于ICP-MS的银标准溶液（相当于过滤前标准银离子溶液）准备如下

        （4）首先将1mg/mL（1000ppm）的银标准溶液用分散介质分别逐级稀释到100μg/L备用。（1000μg/mL→10μg/mL→0.1μg/mL）

        （5）分别取上述100μg/L的银溶液250μL、500μL、2500μL、5mL、10mL、25mL稀释到50mL，用2%硝酸配制成0.5μg/L、1μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L、50μg/L的银标准系列溶液。

         （6）按照本标准测量步骤测定标准银离子溶液（过滤前）金额滤液样品（过滤后）中银含量。

         （7）根据测定值获得标准银离子溶液样品和滤液样品中银含量的比值，得到滤膜分离法对测量的影响。

          B.2 滤膜分离法对银离子回收率的影响

                                                                          附录C

                                                                    （资料性附录）

                                                                          测试报告

                                        表C1. 纳米银材料银离子释放量测试报告

      参考文献

     [1] Lee YJ, Kim J, Oh J, Bae S, Lee S, Hong IS, et al. Ion-release kinetics and ecotoxicity effects of silver nanopaticles. Environmental toxicology and chemistry. 2012, 31: 155-9.

     [2] Yin LY, Cheng YW, Espinasse B, Colman BP, Auffan M, Wiesner M, et al. More than the Ions: The Effects of Silver Nanoparticles on Lolium multiflorum. Environ. Sci. Technol. 2011, 45: 2360-7.

     [3] Lok CN, Ho CM, Chen R, He QY, Yu WY, Sun H, et al. Silver nanoparticles partial oxidation and antibacterial activities. Journal of biological inorganic chemistry: JBIC: a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry. 2007, 12: 527-34.