原子力显微镜法测量纳米粒子的尺寸

引   言　

　　原子力显微镜（Atomic Force Microscopy, AFM）是继扫描隧道显微镜（Scanning Tunneling Microscopy, STM）之后发明的一种具有原子级高分辨的新型仪器，可以在大气和液体环境下对各种材料和样品进行纳米区域的物理性质包括形貌进行探测。本标准文本将概述纳米粒子的原子力显微镜样品制备，以及纳米粒子尺寸的原子力显微镜法测量。相对于扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy，SEM），原子力显微镜具有高分辨、样品表面的三维成像、对样品无破损等优点。但是相对于纳米粒子在溶液中的状态，AFM样品制备过程可能会改变纳米粒子的形貌和聚集状态。

原子力显微镜法测量纳米粒子的尺寸

Measuring the diameters of nanoparticles using atomic force microscopy

　　1 原理

                                                          图1 原子力显微镜的工作原理图（出自豆丁网）

　　原子力显微镜工作原理如图1所示，其使用弹性悬臂（对微弱力非常敏感）上的针尖在样品表面作光栅式扫描。当针尖和样品表面的距离非常接近时，针尖尖端的原子与样品表面的原子之间存在极微弱的作用力（10-12-10-6 N），此时，微悬臂就会发生微小的弹性形变。针尖与样品之间的作用力F与微悬臂的形变之间遵循胡克定律：F=-kx ，其中，k为微悬臂的力常数。所以，只要测出微悬臂形变量的大小，就可以获得针尖与样品之间作用力的大小。针尖与样品之间的作用力与距离有依赖关系，所以在扫描过程中利用反馈回路保持针尖与样品之间的作用力恒定，即保持为悬臂的形变量不变，针尖就会随样品表面的起伏上下移动，记录针尖上下运动的轨迹即可得到样品表面形貌的信息。这种工作模式被称为“恒力”模式（Constant Force Mode），是使用最广泛的扫描方式。原子力显微镜成像也可以使用“恒高”模式（Constant Height Mode），也就是在XY扫描过程中，不使用反馈回路，保持针尖与样品之间的距离恒定，通过测量微悬臂Z方向的形变量来成像。这种方式不使用反馈回路，可以采用更高的扫描速度，通常在观察原子、分子像时用得比较多，而对于表面起伏比较大的样品不适用[1]。

　　原子力显微镜有多种操作模式，常用的有以下三种：接触模式（Contact Mode）、非接触（Non-Contact Mode）、轻敲模式(Tapping Mode)。根据样品表面不同的结构特征和材料的特性以及不同的研究需要，选择合适的操作模式。

　　(1)接触模式﹕针尖始终与样品保持轻微物理接触，以恒高或恒力的模式进行扫描。扫描过程中，针尖在样品表面滑动。通常情况下，接触模式都可以产生稳定的、高分辨率的图像。在接触模式中，如果扫描软样品的时候，样品表面由于和针尖直接接触，有可能造成样品的损伤，因此图像可能会发生扭曲或得到假像。所以接触模式一般不适用于成像生物大分子、低弹性模量样品以及容易移动和变形的样品。

　　(2)非接触模式﹕针尖在样品表面上方振动，始终不与样品接触，探针监测器检测的是范德华力和静电力等对成像样品无破坏的长程作用力。这种模式虽然增加了显微镜的灵敏度，但当针尖与样品之间的距离较长时，分辨率要比接触模式和轻敲模式都低，而且成像不稳定，操作相对困难，在生物中的应用也比较少。

　　(3)轻敲模式﹕微悬臂在其共振频率附近作受迫振动，振荡的针尖轻轻的敲击样品表面，间断的和样品接触，所以又称为间歇接触模式。由于轻敲模式能够避免针尖粘附到样品上，以及在扫描过程中对样品几乎没有损坏。轻敲模式的针尖在接触表面时，可以通过提供针尖足够的振幅来克服针尖和样品间的粘附力。同时，由于作用力是垂直的，表面材料受横向摩擦力、压缩力和剪切力的影响较小。轻敲模式同非接触模式相比较的另一优点是大而且线性的工作范围，使得垂直反馈系统高度稳定，可重复进行样品测量。本标准步骤采用轻敲式扫描来得到纳米粒子的尺寸。

　　2 仪器　　

　　本实验中所用的原子力显微镜仪器为Dimension 3100（美国Veecco公司生产，横向分辨率～1 nm，纵向分辨率～0.2 nm）[2]。仪器的校准应该不少于每年一次。

　　3 试剂和基片

　　丙酮(AR, ≥99.5%)、乙醇(CP, 95%)、超纯水、原子力显微镜样品基片

　　4 样品制备

　　4.1 基片的选择：溶液中的纳米粒子需要分散到平整的基底上。为了保证高度测量的准确，基底表面的粗糙度要远远小于纳米粒子的尺寸。常用的基片有HOPG、高质量的云母、原子级平整的金（111）面（沉积在云母上）和单晶硅片等。根据纳米粒子的具体情况选择合适的基片。

　　4.2   基片的处理：对于HOPG和云母基底，直接用胶带剥离表层以获得新鲜的平整表面。对于原子级平整的金（111）面（沉积在云母上），直接购买的基底保存在真空容器中，然后直接取出使用即可。对于硅基片，首先从直径4英寸的硅片上切取约5mm×5mm的小片，然后清洗硅片。清洗硅片的步骤为：先把硅片放入丙酮中超声3分钟，之后再放入乙醇中超声3分钟，然后放入超纯水中超声3分钟。最后用超纯水冲洗硅片，并用氮气吹干。硅片的清洗也可以使用氧气等离子体进行清洗。

　　4.3 纳米粒子在基片上的分散：用移液器吸取20µL纳米粒子溶液滴加到准备好的基片上，放进真空干燥器中，等溶剂挥发完全，备用。

　　5 测量步骤

　　5.1 开机：依次打开电脑主机、原子力显微镜控制器和软件。

　　5.2 针尖的安装：探针是由悬臂和其一段的尖锐的针尖组成的。悬臂和针尖的性能尺度决定了原子力显微镜的灵敏度和分辨率。针尖的关键参数的参考值：100－500kHz共振频率，力常数在10-80 N/m范围，针尖顶端曲率半径小于12nm。一般商业的AFM针尖一般满足上述要求。

　　5.3 光学显微镜定位测量点：使用原子力显微镜内置的光学显微镜，找到样品上合适的成像位置，并将原子力显微镜针尖移动到该位置。

　　5.4 设置成像模式：选择轻敲模式。

　　5.5 设置扫描参数：原子力显微镜图像有横向（XY）和垂直（Z）分辨。针尖的曲率半径决定了最高的横向分辨率。然而，还有一个因素在图像分析中需要考虑，即是数据点数，或者叫像素。例如，得到一个10μm ×10 μm的图像，512像素，那么像素尺寸即是19.5 nm。因此10 μm扫描范围，不可能得到小于19.5 nm物体的真实图像。因此选择扫描范围的时候，根据纳米粒子的尺寸选择合适的扫描范围。

　　5.6 采集图像：先扫比较大的范围以便找到纳米粒子较均匀分布的区域，找到理想区域后，缩小扫描范围，开始收集纳米粒子图像。通过调节振动振幅来保证trace和retrace线近于重合。保存图像在电脑的文件夹并命名，以备图像处理和分析。

　　6 数据分析[3]

　　6.1 图像拉平（Flatten）：通常，原子力显微镜图像处理的第一步是逐行拉平以除去图像采集过程中的一些失真信息。例如，样品不总是完美地和针尖垂直，导致测到的图像中样品表面出现实际上并不存在的倾斜或翘起的现象。别的信号失真来源还包括热漂移和扫描管的非线性。拉平技术通过多项式拟合每一条扫描线，可以修正这些信号失真，并把它们从数据中去除掉。通常线性拉平就足以去除这些失真信息。在纳米粒子出现的情况下，拉平处理变得有点困难了。软件试图对基底和纳米粒子同时做多项式拟合，而非只对基底进行拟合。为了消除拉平处理过程中的这个因素的影响，大多数AFM软件包包括“排除点”功能。基本上这个功能将在拉平过程中排除所有选择的点，从而在拉平基底的过程中有效忽略这些纳米粒子。

　　6.2 横截面轮廓分析：原子力显微镜软件包中另一个常用功能是横截面工具。在图像的任意部分划横截面线，沿这条线的垂直轮廓即会显现出来。光标移动可以进行水平、垂直和角向测量。对一个纳米粒子做几条横截面线，不仅可以计算粒子高度，而且可以确定纳米粒子是否孤立，是否处在平面区域边缘。

　　6.3 高度测量：通过每一个纳米粒子画一条横截面线，如图2所示。用光标找到基线的平均值和峰高。如果拉平过程做得合适（即纳米粒子在拉平过程中被排除），基线沿扫描线会相对平整。从峰高中减去平均基线高度，可以得到纳米粒子的高度。对至少100个纳米粒子重复这个过程以便作统计分析。大的团聚和外来粒子应该从平均数据中排除出去。

                                                   图2 利用横截面线轮廓分析获得纳米粒子的高度

　　6.4 自动批处理模式粒子分析方法：大多数软件包提供了自动粒子分析功能。用阈值法，基于像素的高度数据，软件可以测量粒子高度并画出直方分布图。在进行批处理之前，必须进行上述拉平处理以保证基底平整。通过调整高度阈值，阈值以上的粒子都会被包括在分析范围，阈值以下的粒子将被排除在外。选择一组粒子之后，来自粒子和基底的最大高度间的间距可以被自动测量出来，并且高度平均值和粒子标准差可以被计算出来。批处理高度分析使得研究者可以在较短时间内对大量粒子进行分析。

　　6.5 粒子尺寸分析报告：根据以下步骤来计算粒子高度分布的平均值和扩展的不确定度。粒子高度平均值或代数平均值X的计算公式如下：

　　其中n是测量的粒子数，Xi是每个粒子的高度。描述平均值变化的最常用方法是标准偏差，或者更简单的均方差：

　　因此，粒子的尺寸可以表示为：X+uX。

　　7 参考文献

　　[1]“原子力显微镜的基本原理及其方法学研究”, 朱杰，孙润广,生命科学仪器, 2005, 3(1), 22-26

　　[2] “Dimension 3100 Manual”, Copyright © 2003Digital Instruments Veeco Metrology Group

[3]‘Size Measurement of Nanoparticles Using Atomic Force Microscopy’, Assay Cascade Protocols, Frederick National Lab, Nanotechnology Characterization Laboratory, ncl.cancer.go.

国家纳米科学中心分析报告