扫描电子显微镜法测量纳米粒子的尺寸

引   言

　　本标准文本主要介绍了用高分辨扫描电子显微镜（Scanning Electron Microscopy）测量纳米粒子尺寸的方法以及样品制备过程。纳米粒子通常是不规则的球型，例如三角形、六角形或矩形，还有一些纳米粒子甚至为复杂的菱形或圆柱。扫描电子显微镜成像是二维的，这就导致非球型的纳米粒子的粒径大小存在争议。然而，通过统计基底上大量随机的纳米粒子的粒径大小，就可得到比较可信的结果。

扫描电子显微镜法测量纳米粒子的尺寸

Measuring the size of nanoparticles using scanning electron microscopy

1.原理

　　扫描电子显微镜的工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角、材料特性有关。次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器检测转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号，控制荧光屏显示出与电子束同步的扫描图像[1]。

　　由电子枪发射的电子，以其交叉斑作为电子源，经二级聚光镜及物镜的缩小形成具有一定能量、一定束流强度和束斑直径的微细电子束。在扫描线圈驱动下，电子束在试样表面作栅网式扫描。聚焦电子束与试样相互作，产生二次电子发射（以及其它物理信号）。二次电子信号被电子探测器收集转换成电信号，然后通过计算机及其软件在显示器上显示反映试样表面形貌的二次电子像。次级电子和背散射电子可以用于成像。扫描电子显微镜的分辨率由电子束和样品的相互作用体积（Interaction Volume）决定，一般扫描电子显微镜的分辨率在1-20nm，先进的仪器可以达到优于1nm的分辨率。

2.仪器　　

　　本实验中所用的扫描电子显微镜仪器是日立公司生产的Hitachi S-4800。该电镜的电子发射源为冷场场发射枪，物镜为半浸没式。在高加速电压（15kV）下，S-4800的二次电子图像分辨率为1 nm，这是目前半浸没式冷场发射扫描电镜所能达到的最高水平。该电镜在低加速电压（1kV）下的二次电子图像分辨率为2nm，这有利于观察绝缘或导电性差的样品。S-4800的主要附件为X射线能谱仪。利用S-4800和X射线能谱仪可以在观察样品表面微观形貌的同时进行微区成分定性和定量以及元素分布分析。此次所购X射线能谱仪的元素分析范围为Be4~U92，从而可以分析轻元素。由于S-4800不能在低真空条件下工作，因此不适合直接观察含水和含油样品。仪器的校准应该不少于每年一次。

　　本实验中还会用到氧气等离子清洗仪。

3.试剂　   

　　异丙醇（CP，≥99.5%）、丙酮(AR, ≥99.5%)、乙醇(CP, 95%)、超纯水、氨水、硅片(带300nm SiO2层 )

4.样品制备[2]

　　4.1 处理纳米材料时，采取适当的防护措施。

　　4.2 用于准备和处理纳米粒子样品的工具应该用去离子水清洗干净并干燥保存。

　　4.3 悬浮、过滤、冲洗的溶液应事先用0.1µM或更小的滤膜过滤。

　　4.4 对于扫描电子显微镜测量，纳米粒子可以沉积在不同的表面（通常用硅片），可采用原始浓度或适当稀释。然而，这可能使得到的样品不够理想。通常纳米粒子溶液为水溶液，而硅片是疏水的。因此可以使用氧气等离子体清洗处理硅片1-3分钟。

　　4.5 将纳米粒子沉积在处理过的硅片表面。所需要的时间根据纳米粒子的大小和浓度决定，可能需要实验来确定。通常1-2小时是合适的。当时间较短时，粒子相互之间离得很远，尤其是对10nm的粒子。要使纳米粒子沉积在基底上，需要将一大滴溶液滴在基底上并保持足够长的时间。不需要将液滴控制得很小，而需要液滴覆盖大部分硅片的表面。最后，把样品放在真空干燥器中，约1-2小时，使液滴完全干燥。

　　4.6 用这种方法制备的样品，纳米粒子会随机分布在硅片上，并且密度合适，纳米粒子的分散性较好。需要指出的是，本过程不会引起纳米粒子形状和尺寸的改变。样品制备好后，最好尽快测量。

5.测量步骤

　　5.1 开机：接通配电盘电源，拔上MAIN Switch开关，按一下Reset按钮，然后将MAIN控制面板上EVAC   POWER按至ON，SC EVAC指示灯处于常绿状态后，等半小时后按下Display开关至ON, PC 自动开机进入用户界面并自动运行PC_SEM程序。

　　5.2 装入样品：把样品用导电胶带粘到样品托上，把样品托装入样品座，并用比高器确定高度并旋紧，按AIR按钮打开交换室，将样品座插在样品交换杆上，并锁紧，将交换杆拉至尽头卡紧，关闭交换室。然后按下EVAC按钮，等指示灯为绿色，按下OPEN按钮打开MV-1，推进交换杆，旋转样品杆UNLOCK位置后拉出交换杆，按下CLOSE按钮。

　　5.3 获取图像：SC真空恢复正常后（显示为L E-3），选择适当的加速电压（Vacc），加高压，在TV模式下将图像调节清楚（聚焦、消象散），点击Slow3确认图像质量，然后点击Capture按钮拍照。最后，点击右下方Save按钮，选择保存位置、使用者及样品信息，保存图像。

　　5.4 结束成像：点击OFF按钮关闭加速高压，将放大倍率降至低倍模式，按操作界面上home使样品台回到初始位置，并依照装入样品的方式反序取出样品。

　　5.5 关机：退出PC_SEM程序，退出Windows XP系统，关闭DISPLAY。

6.数据分析

　　NIH ImageJ 用于数据的分析和测量。对粒子分割的关键步骤是采用ImageJ中的不同方法进行分割，Otsu threshold被认为是最准确的方法。本过程会产生二进制版本的图像，纳米粒子是白色的而背景是黑色的。分割以后“Analyze Particles”被用于计数和测量粒子在二进制中的图像。粒子的轮廓可以检验粒子与背景分离的质量。ImageJ 给出图像中每个粒子的测量结果，并在电子数据表中输出，待用。

　　用imageJ观测的粒子的面积被转换成以像素为单位的有效直径值，忽略特殊粒子的形状。使用之前螺距测量的校准结果，这个值进一步转化为以纳米为单位的长度值。从一个图像中的多数粒子和不同样品区域的多个图像，可得到粒子的平均有效直径和标准偏差。

　　要想得到准确的测量结果，需要粒子以合适的密度随机分布在硅基底上，并且可以很容易地与背景区分。此外，图像不仅提供了粒子的尺寸信息。粒子是三维结构的，但他们的大多数是不规则的，有一些甚至是很奇怪的形状。有的是三角形、六边形、长方形或者是球形的。有的甚至是多面体的、对称的、钻石型或圆柱形。

　　本工作的范围限制在纳米粒子平均尺寸的测量。SEM图像是纳米粒子在硅基底上的二维投影。粒子的形状并不是规则的球形或多面体，这就使得粒子的平均粒径大小有些不准确。然而，通过统计和测量大量的粒子，有可能达到有效的粒子直径结果。另外对于投影接近圆形的纳米粒子，可以使用圆度值评估粒子接近圆形的程度[3]。

　　纳米粒子的圆度值，由4 πA/P2计算，其中A表示粒子面积，P表示周长，这个值接近1是理想圆形。圆度值小于等于0.25的纳米粒子可被认为是聚集或数据分析中的误差。

7.参考文献

[1]“材料分析方法”第二版, 周玉，机械工业出版社, 2004.11

[2] GB/T 20307-2006, 纳米级长度的扫描电镜测量方法通则

[3]“Measuring the Size of Colloidal Gold Nanoparticles Using High-Resolution   Scanning Electron Microscopy Assay Cascade Protocols, Frederick National Lab, Nanotechnology Characterization Laboratory, ncl.cancer.gov.

                                                  国家纳米科学中心分析报告