鲎试剂法终点显色法定量检测纳米粒子中革兰氏阴性菌内毒素含量

2019-10-23 10:36来源:医用纳米材料检测与评价标准网址:http://www.nanoctr.cas.cn浏览数:255 


引   言

  本文描述的实验方法可以通过终点鲎试剂(Limulus amebocyte lysate, LAL)法实现定量分析纳米粒子中革兰氏阴性菌内毒素的含量。本法是根据Pirece公司的QCL-1000试剂盒以及美国国家药典(United State Pharmacopeia, USP)标准85“细菌内毒素检测以及美国NCL提供的方法编写的[1-3]。亦可参照国家标准,对样品进行检测[4-6]

鲎试剂法终点显色法定量检测纳米粒子中革兰氏阴性菌内毒素含量

Detection and quantification of gram negtive bacterial endotoxin contamination in nanoparticle formulations by end point chromogenic limulus amebocyte lysate(LAL) assay

1.原理

  革兰氏阴性菌内毒素可与LAL中的一种酶反应,释放出黄色的p-硝基苯胺(p-nitroaniline, pNA)。加入冰醋酸或十二烷基硫酸钠(SDS)可以终止p-硝基苯胺的释放,底物可通过405nm的吸光度测量。样品中内毒素的浓度直接与吸光度是成比例的,可根据标准曲线计算出来。本检测方法大概需要1mg左右的纳米材料。

  

2.仪器与试剂

  以下列出的产品供应商仅以提供产品信息为目的,可以由同类产品的其他供货商所替代。

  2.1 试剂

  

  2.2 耗材 

  移液管(2mL5mL10mL)、96孔平底细胞培养板、一次性无内毒素玻璃管(12x75mmACC, TB240)、无热源离心管(15mL

  2.3 仪器

  离心机、冰箱(4°C-20°C)、生物安全柜(可处理生物相关材料)、涡旋混匀仪、酶标仪

3.试剂配制

  3.1 氢氧化钠溶液(0.1N):使用无热源的水配制一定体积的0.1N NaOH溶液,使用无热源的离心管储存。

  3.2 盐酸溶液(0.1N):使用无热源的水将HCl储存液稀释至0.1N,使用无热源的离心管储存仪器。

  3.3 参考标准内毒素(RSE)储存液:试剂盒中提供的干粉状大肠杆菌脂多糖(E.coli lipophlusaccharide, LPS)是经过USP认证的参考标准内毒素(Reference standard endotoxin, RSE)。将其溶于1mL无热源水中,终浓度控制在15-40U/mL。实际浓度取决于每个试剂盒提供的分析证书上的数据。每次使用前,储存液需彻底混匀,并达到室温。

  3.4 计算标液(C1-C4):下表为一系列不同浓度的计算标液配制的示例。各个标液的体积可根据实际需要进行调整。其中储存液为4.3中提及的RSE储存液,X为储存液的浓度。

  

  3.5 质控标液(Q1):下表为一系列不同浓度的计算标液配制的示例。各个标液的体积可根据实际需要进行调整。其中储存液为4.3中提及的RSE储存液,X为储存液的浓度。纳米粒子溶液的浓度应与实验中待测样品浓度相当。

  

  3.6   抑制或增强对照(IEC):下表为一系列不同浓度的计算标液配制的示例。各个标液的体积可根据实际需要进行调整。其中储存液为3.3中提及的RSE储存液,X为储存液的浓度。纳米粒子溶液的浓度应与实验中待测样品浓度相当。

  

4.样品制备

  样品建议溶解于无热源的水中,或是无菌无热源的PBS中,终浓度为1.0mg/mL。使用0.1N NaOH或0.1N HCl调节样品溶液的pH值至6.0-8.0。为避免样品被pH电极污染,通常取出少量体积,使用pH试纸测试。如果样品溶于PBS中,则空白PBS也需在实验中进行检测

5.测量步骤

  5.1 将上述配制好的溶液按照图1所示加入37°C预热的无菌96孔板中,每孔50mL。其中空白水对照4孔,其余对照及待测样品,每种溶液2孔。37°C培养5min。(加入前,彻底混匀所有的溶液)。

  5.2LAL试剂加入到所有孔中,每孔50mL。轻轻摇动混匀,37°C培养10min。

  5.3 将显色底物溶液加入到所有孔中,每孔100mL。轻轻摇动混匀,37°C培养6min。

  5.4 将终止溶液(10% SDS)加入到所有孔中,每孔50mL。轻轻摇动混匀。

  5.5 使用酶标仪读取405nm处的吸光度。

  5.61:96孔板加样图例。其中Q1为质控标液,C1-C4为计算标液,IEC为抑制/增强对照。

  

6.数据分析

  6.1 变化系数百分比:CV% = SD/mean x 100,其中SD为标准偏差,mean为平均值。

  6.2 理论误差百分比(Percent Difference from Theoretical, PDFT):PDFT =(RSE浓度计算值 - RSE浓度理论值)/ RSE浓度理论值 x 100%。

  6.3 利用线性回归法做出标准曲线。

7.接受标准

  7.1 对于每个对照组以及检测的样品,CV%PDFT不能超过25%。

  7.2 如果质控溶液没能达到上述接受标准,此检测需要重复。

  7.3 标准曲线的相关系数不小于0.980。

  7.4 如果标准曲线不能符合8.1和8.3的接受标准,此检测需要重复。

  7.5 在本实验进行之前,应先检测待测样品本身是否在405nm有吸收。在96孔板中,加入50mL样品溶液,150mL无热源水和50mL终止溶液,不孵育,直接检测405nm处的吸光度。如果吸光度大于水的吸光度,则说明样品本身有吸收,需将本实验中作为空白对照,改为样品溶液直接混合终止溶液为空白对照。

  7.6 IEC的测量值与样品溶液测量值之间的差值应为0.4EU/mL±25%,即0.3~0.5EU/mL。如果差值在此范围以外,则该浓度的样品对内毒素检测是有影响的(抑制或增强)。则需要使用稀释法,对样品进行稀释后,再测量IEC。直到找到一个对内毒素检测无影响的合适的样品浓度。如下表示例。

  

  7.7 美国食品药品管理局(Food and drug administration, FDA)批准了以下相关的上限标准:设备:0.5EU/mL,与脑脊液接触的设备为0.06EU/mL;非肠道药物:K/MK为法定限制,5EU/kgM为每小时最大的用药剂量;鞘内注射的非肠道药:K/MK为法定限制,0.2EU/kgM为每小时最大的用药剂量。如没有提供K/M值,纳米粒子相关配方将以设备标准为准。

8.缩略语

  EU:内毒素单位(标准鲎试剂的最低促凝胶活性值定为内毒素单位1EU)

  FBS:胎牛血清

  LAL:鲎试剂

  LPS:脂多糖

  IEC:抑制/增强对照

  min:分钟

  PBS:磷酸缓冲盐溶液

  PDFT:理论误差百分比

  RSE:参考标准内毒素

  SDS:十二烷基硫酸钠

  USP:美国国家药典

  v/v:体积比

9.参考文献

[1]Pierce® LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation kit instruction (#88282), Thermo Fisher Scientific Inc.

[2]USP34-NF29. <85>. Bacteria Endotoxins. Rockville, MD: United States Pharmacopeia. (2011) 1: 78-81.

[3]Dobrovolskaia MA, Neun BW. NCL Method (2011) STE-1.1 (Version 1.2):1-10.

[4]ISO-29701纳米技术纳米材料体外内毒素试验鲎试剂(LAL)测定法(Nanotechnologies-Endotoxin test on nanomaterial samples for in vitro systems-Limulus amebocyte lysate(LAL) test).

[5]GB/T14233.2-2005,医用输液、输血、注射器具检验方法 2部分:生物学试验方法。

[6]YY/T 1295-2015,医疗器械生物学评价 纳米材料:细菌内毒素试验。

                                                        国家纳米科学分析报告