鲎试剂法终点显色法定量检测纳米粒子中革兰氏阴性菌内毒素含量引 言 本文描述的实验方法可以通过终点鲎试剂(Limulus amebocyte lysate, LAL)法实现定量分析纳米粒子中革兰氏阴性菌内毒素的含量。本法是根据Pirece公司的QCL-1000试剂盒以及美国国家药典(United State Pharmacopeia, USP)标准85“细菌内毒素检测”以及美国NCL提供的方法编写的[1-3]。亦可参照国家标准,对样品进行检测[4-6]。
鲎试剂法终点显色法定量检测纳米粒子中革兰氏阴性菌内毒素含量 Detection and quantification of gram negtive bacterial endotoxin contamination in nanoparticle formulations by end point chromogenic limulus amebocyte lysate(LAL) assay 1.原理 革兰氏阴性菌内毒素可与LAL中的一种酶反应,释放出黄色的p-硝基苯胺(p-nitroaniline, pNA)。加入冰醋酸或十二烷基硫酸钠(SDS)可以终止p-硝基苯胺的释放,底物可通过405nm的吸光度测量。样品中内毒素的浓度直接与吸光度是成比例的,可根据标准曲线计算出来。本检测方法大概需要1mg左右的纳米材料。
2.仪器与试剂 以下列出的产品供应商仅以提供产品信息为目的,可以由同类产品的其他供货商所替代。 2.1 试剂
2.2 耗材 移液管(2mL,5mL,10mL)、96孔平底细胞培养板、一次性无内毒素玻璃管(12x75mm,ACC, TB240)、无热源离心管(15mL) 2.3 仪器 离心机、冰箱(4°C和-20°C)、生物安全柜(可处理生物相关材料)、涡旋混匀仪、酶标仪 3.试剂配制 3.1 氢氧化钠溶液(0.1N):使用无热源的水配制一定体积的0.1N NaOH溶液,使用无热源的离心管储存。 3.2 盐酸溶液(0.1N):使用无热源的水将HCl储存液稀释至0.1N,使用无热源的离心管储存仪器。 3.3 参考标准内毒素(RSE)储存液:试剂盒中提供的干粉状大肠杆菌脂多糖(E.coli lipophlusaccharide, LPS)是经过USP认证的参考标准内毒素(Reference standard endotoxin, RSE)。将其溶于1mL无热源水中,终浓度控制在15-40U/mL。实际浓度取决于每个试剂盒提供的分析证书上的数据。每次使用前,储存液需彻底混匀,并达到室温。 3.4 计算标液(C1-C4):下表为一系列不同浓度的计算标液配制的示例。各个标液的体积可根据实际需要进行调整。其中储存液为4.3中提及的RSE储存液,X为储存液的浓度。
3.5 质控标液(Q1):下表为一系列不同浓度的计算标液配制的示例。各个标液的体积可根据实际需要进行调整。其中储存液为4.3中提及的RSE储存液,X为储存液的浓度。纳米粒子溶液的浓度应与实验中待测样品浓度相当。
3.6 抑制或增强对照(IEC):下表为一系列不同浓度的计算标液配制的示例。各个标液的体积可根据实际需要进行调整。其中储存液为3.3中提及的RSE储存液,X为储存液的浓度。纳米粒子溶液的浓度应与实验中待测样品浓度相当。
4.样品制备 样品建议溶解于无热源的水中,或是无菌无热源的PBS中,终浓度为1.0mg/mL。使用0.1N NaOH或0.1N HCl调节样品溶液的pH值至6.0-8.0。为避免样品被pH电极污染,通常取出少量体积,使用pH试纸测试。如果样品溶于PBS中,则空白PBS也需在实验中进行检测 5.测量步骤 5.1 将上述配制好的溶液按照图1所示加入37°C预热的无菌96孔板中,每孔50mL。其中空白水对照4孔,其余对照及待测样品,每种溶液2孔。37°C培养5min。(加入前,彻底混匀所有的溶液)。 5.2 将LAL试剂加入到所有孔中,每孔50mL。轻轻摇动混匀,37°C培养10min。 5.3 将显色底物溶液加入到所有孔中,每孔100mL。轻轻摇动混匀,37°C培养6min。 5.4 将终止溶液(10% SDS)加入到所有孔中,每孔50mL。轻轻摇动混匀。 5.5 使用酶标仪读取405nm处的吸光度。 5.6 图1:96孔板加样图例。其中Q1为质控标液,C1-C4为计算标液,IEC为抑制/增强对照。
6.数据分析 6.1 变化系数百分比:CV% = SD/mean x 100,其中SD为标准偏差,mean为平均值。 6.2 理论误差百分比(Percent Difference from Theoretical, PDFT):PDFT =(RSE浓度计算值 - RSE浓度理论值)/ RSE浓度理论值 x 100%。 6.3 利用线性回归法做出标准曲线。 7.接受标准 7.1 对于每个对照组以及检测的样品,CV%和PDFT不能超过25%。 7.2 如果质控溶液没能达到上述接受标准,此检测需要重复。 7.3 标准曲线的相关系数不小于0.980。 7.4 如果标准曲线不能符合8.1和8.3的接受标准,此检测需要重复。 7.5 在本实验进行之前,应先检测待测样品本身是否在405nm有吸收。在96孔板中,加入50mL样品溶液,150mL无热源水和50mL终止溶液,不孵育,直接检测405nm处的吸光度。如果吸光度大于水的吸光度,则说明样品本身有吸收,需将本实验中“水”作为空白对照,改为“样品溶液直接混合终止溶液”为空白对照。 7.6 IEC的测量值与样品溶液测量值之间的差值应为0.4EU/mL±25%,即0.3~0.5EU/mL。如果差值在此范围以外,则该浓度的样品对内毒素检测是有影响的(抑制或增强)。则需要使用稀释法,对样品进行稀释后,再测量IEC。直到找到一个对内毒素检测无影响的合适的样品浓度。如下表示例。
7.7 美国食品药品管理局(Food and drug administration, FDA)批准了以下相关的上限标准:设备:0.5EU/mL,与脑脊液接触的设备为0.06EU/mL;非肠道药物:K/M。K为法定限制,5EU/kg。M为每小时最大的用药剂量;鞘内注射的非肠道药:K/M。K为法定限制,0.2EU/kg。M为每小时最大的用药剂量。如没有提供K/M值,纳米粒子相关配方将以设备标准为准。 8.缩略语 EU:内毒素单位(标准鲎试剂的最低促凝胶活性值定为内毒素单位1EU) FBS:胎牛血清 LAL:鲎试剂 LPS:脂多糖 IEC:抑制/增强对照 min:分钟 PBS:磷酸缓冲盐溶液 PDFT:理论误差百分比 RSE:参考标准内毒素 SDS:十二烷基硫酸钠 USP:美国国家药典 v/v:体积比 9.参考文献 [1]Pierce® LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation kit instruction (#88282), Thermo Fisher Scientific Inc. [2]USP34-NF29. <85>. Bacteria Endotoxins. Rockville, MD: United States Pharmacopeia. (2011) 1: 78-81. [3]Dobrovolskaia MA, Neun BW. NCL Method (2011) STE-1.1 (Version 1.2):1-10. [4]ISO-29701纳米技术纳米材料体外内毒素试验鲎试剂(LAL)测定法(Nanotechnologies-Endotoxin test on nanomaterial samples for in vitro systems-Limulus amebocyte lysate(LAL) test). [5]GB/T14233.2-2005,医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分:生物学试验方法。 [6]YY/T 1295-2015,医疗器械生物学评价 纳米材料:细菌内毒素试验。
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