凝血检测

引   言

　　本文描述了一种评估纳米粒子制剂影响血浆凝固时间的实验方法。凝血，即血液凝固，是一个很复杂的过程。主要有三种途径：内源性（也称接触激活途径，因为它是由受损的表面激活的）、外源性（也称组织因子途径）和共同途径。每一途径都可通过特殊的检测进行评价。例如，激活部分促凝血酶原激酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）检测可以评价内源性途径，凝血酶原时间（prothrombin time，PT）检测可评价外源性途径，而凝血酶时间（thrombin time，TT）可以指示共同途径的功能性。每一途径都包括许多凝血因子，其中一些在不同的途径中都发挥作用。APTT检测测量的是因子XII、XI、IX、VIII、X、V、II，PT检测测量的是因子VII、X、V、II。三种方法都可以检测纤维蛋白原。商业化发体外检测中，PT检测主要用于筛查凝血因子VII的缺乏，APTT用于检测凝血因子XII的不足，TT检测用于评价纤维蛋白原的消耗[1]。

凝血检测

Coagulation assay

1.原理

　　本检测将通过三个独立实验分析血浆凝固：凝血酶原时间（PT）、激活部分促凝血酶原激酶时间（APTT）和凝血酶时间（TT）。将纳米粒子和新鲜人血浆（乏血小板）共同孵育，使用血凝度计检测凝血时间，与各检测项目的标准对照进行比较。当正常血浆在体外接触纳米粒子后，预期将缺失某种凝血因子而导致血浆凝固延迟。凝血检测也可按照国家标准[2-3]进行。

2.仪器与试剂

　　以下列出的产品供应商仅以提供产品信息为目的，可以由同类产品的其他供货商所替代。

　　2.1 试剂

　　2.2 耗材　　

　　1.5mL EP管、量程包括0.05至10mL的移液器

　　2.3 仪器

　　离心机、冰箱，2-8℃、ACL-TOP全自动凝血分析仪（Instrumentation Laboratory.Co，美国）

3.试剂配制

　　3.1 检测血浆：使用1h内收集的新鲜全血，2500xg，20-22℃，离心10min，收集血浆并混合。混合好的血浆在室温可稳定存放8h，不能冷藏或冷冻。

　　3.2 纳米粒子处理的检测血浆：在1.5mL离心管中混合50μL纳米粒子（步骤5中制备）和500μL检测血浆（步骤4.1），混匀后在37℃孵育30min。每种待测样品制备3份平行样。

　　3.3 阴性对照：在1.5mL离心管中混合50μL 1xPBS和500μL检测血浆（步骤4.1），制备2份平行样。混匀后在37℃孵育30min。

　　3.4 体系对照：500μL检测血浆（步骤3.1），制备2份平行样，与上述样品一起在37℃孵育30min。

4.样品制备：纳米粒子溶液的配制

　　本实验需要160μL 10倍最高检测浓度的纳米粒子，溶解或重悬于1xPBS或其他适当介质中。选择合适的银纳米粒子溶液的浓度时，必须考虑以下几个问题：银纳米粒子在某种生物相容性缓冲液中的溶解度；生理条件下的pH值；纳米材料的可用性及稳定性。纳米粒子常规需要检测四个浓度：1.0、0.2、0.04和0.008mg/mL。但是，当体内PK实验已知纳米粒子在血浆中的浓度时，最高体外检测浓度可以选择该浓度的10倍、30倍或100倍。其他三个检测浓度可以由最高浓度连续1:5稀释获得。在最初的筛查中，推荐使用可能的最高浓度。当纳米粒子携带药物时，浓度选择需根据活性药物成分（API）而不是整个合成物来确定。如果最高检测浓度是1.0mg/mL，纳米粒子储液的浓度应为10mg/mL（在检测过程中，样品会被稀释10倍，见步骤4.2）。每个检测浓度（1.0、0.2、0.04和0.008mg/mL）均需进行3份50μL的平行测定（n=3）。

5.实验步骤

　　5.1 参考仪器快捷设置列表及试剂体积，设置四种检测的仪器参数。仪器使用前需预热5-10min。

　　5.2 将孵育好的样品转入比色皿中。

　　5.3 在凝血分析仪指定位置加入相应PT、TT及APTT检测试剂，然后在检测行中依次放入比色皿。

　　5.4 机器开始检测，并给出相应的数值。

6.计算

　　根据下式计算每个对照和检测样品的变化系数百分比：

7.接受标准

　　每个对照和检测样品的CV%应不超过5%。

8.缩略语

　　API：活性药物成分

　　APPT：激活部分促凝血酶原激酶时间

　　CV：变化系数

　　h：小时

　　min：分钟

　　N：正常

　　PK：药物代谢动力学

　　PT：凝血酶原时间

　　SD：标准偏差

　　TT：凝血酶时间

9.参考文献

[1]Dobrovolskaia MA, Neun BW. Coagulation Assays. NCL Method (2011) ITA-12 (Version 1.1):1-8.

[2]GB/T16886.4-2003/ISO 10993-4:2002，医疗器械生物学评价 第4部分 与血液相互作用试验选择.

[3]GB/T14233.2-2005，医用输液、输血、注射器具检验方法 第2部分：生物学试验方法。

　　国家纳米科学中心分析报告