肾细胞毒性检测

---

引   言

　　本实验方案描述纳米粒子对于猪的近端肾小管细胞（LLC-PK1）的细胞毒性检测。本文采用的是乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase, LDH）释放法[1, 2]。

肾细胞毒性检测

Cytotoxicity assay for kidney cells

1.原理

　　本法利用Roche 公司的乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase, LDH）细胞毒性检测试剂盒[3]。LDH是一种细胞裂解时释放到细胞质的胞质酶。因此，LDH法可以检测膜的完整性。LDH法测定的原理：（1）乳酸脱氢酶氧化乳酸盐为丙酮酸盐；（2）丙酮酸盐与四氮唑盐（2-(p-iodophenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyltetrazolium chloride, INT）反应形成的甲臜；（3）用分光光度法检测水溶的性甲臜染料[4-6]。也可根据样品来源不同，按照参考文献[7]检测。

2.仪器与试剂

　　以下列出的产品供应商仅以提供产品信息为目的，可以有同类产品的其他供货商所替代。

　　2.1 试剂

　　

　　2.2 耗材

　　移液管（2mL，5mL，10mL）、24孔和96孔平底细胞培养板、离心管（1.5mL, 5mL和15mL）

　　2.3 仪器

　　离心机（带有96-孔板适配器）、冰箱（4℃和-20℃）、细胞培养箱（37℃，5%CO2，95%湿度）、生物安全柜（可处理生物相关材料）、倒置荧光显微镜、血细胞计数器（细胞计数仪）、涡轮混匀仪、酶标仪、平板振荡器。

　　2.4 细胞系

　　LLC-PK1（猪的近端肾小管细胞系）

3.试剂配制

　　3.1 M199完全培养基（无菌）：5%FBS（经过热灭活）、2nM Glutamax、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、1.5g/L到2.2g/L NaHCO3。避光保存在2-8℃，不超过一个月。使用前，要37℃水浴中预热。

　　3.2 检测培养基（Assay medium，AM）：1% FBS（经过热灭活）、2mM Glutamax、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、M199培养基。避光保存在2-8℃，不超过一个月。使用前，要37℃水浴中预热。

　　3.3 热灭活FBS：在2-8℃解冻一瓶FBS，热灭活前恢复至室温。放入56℃水浴中30min，并且每隔5min混匀一次。根据每次实验的用量（~50mL），分装后保存在-20℃。每次使用前，在2-8℃解冻。剩余FBS可在2-8℃保存一个月。

　　3.4 1% Triton-X-100溶液（最大稀释对照）：用一定体积的AM稀释Triton-X-100，终浓度为1%。然后0.2μm过滤除菌。

　　3.5 25mM APAP溶液（阳性对照）：将19mg的APAP溶于5mL AM中，终浓度为25mM。然后0.2μm过滤除菌。

　　3.6 LDH相关溶液的配制：（1）将1瓶催化剂溶于1mL蒸馏水中，10min，涡旋混匀（在4℃可保存几周）。（2）反应液：根据检测样品的数量，100μL/孔，将上述催化剂溶液和染料按照1:45的比例配置，建议现配现用。（在4℃可保存几周）。（3）LDH标液：将一定量的LDH标液溶于AM中，终浓度为0.05U/mL。

4.样品制备：纳米粒子样品溶液的配制

　　4.1 将待测样品完全溶解在AM中，浓度为1x终浓度。如果被检测的银纳米粒子的最高工作浓度为1mg/mL，那么需要检测浓度按照1:5的稀释比例，依次稀释至0.2mg/mL、0.04mg/mL和0.008mg/mL。每一个浓度的纳米粒子应该被分析3次，每次两个重复（n=6）。

　　4.2 选择合适的纳米粒子溶液的浓度时，必须考虑以下几个问题：纳米粒子在某种生物相容性缓冲液中的溶解度、生理条件下的pH值（6-8）、纳米粒子的可用性及稳定性。如果1mg/mL的最高工作浓度不适合，需要对此浓度进行调整，一定要在适合的浓度下分析样品。

　　4.3 预实验（确认纳米粒子对于LDH活性是否产生影响）

　　4.3.1 样品组选择3个浓度（低、中、高）进行预实验，对照组为AM。每个样品组或对照组设置3个平行孔。

　　4.3.2 在所有的孔中加入100μL M199完全培养基。按表1，在相应的孔中加入50μL LDH标液（0.05U/mL）、50μL不同浓度的样品溶液（4x终浓度）或AM，使得每孔的总体积为200μL。

　　4.3.3 混合后直接用于检测，或培养不同的时间（24h、48h）后再检测。检测前，将100μL上清液转移至另一块96孔板中，每个孔加入100μL反应液混合，震荡混匀后，室温避光反应30min。

　　4.3.4 在酶标仪中测试4.3.3混合溶液在490nm和680nm处的吸光度。

　　4.3.5 比较B-A与D-C两个差值，根据T-test结果，判断样品是否会干扰LDH检测，在后续正式实验中，避免使用有影响的样品浓度。

　　    表1 预实验每个实验组的加样设计方案

5.实验步骤

　　5.1 培养细胞2天后，细胞密度达到80-90%。收集细胞，用台盼蓝进行细胞计数。如果活细胞比例达到90%以上，可以继续后面的实验。

　　5.2 将细胞重悬至M199完全培养基中，终浓度为2×105cell/mL（LLC-PK1）。

　　5.3 按处理时间不同准备2个24孔板（分别为24和48小时），按照图1每孔加入500μL细胞悬液，每个样品或对照徐对应两个重复孔。（每组设1个无细胞对照孔，此时为空）

　图1 24孔板加样图。样品1-4为不同浓度的样品溶液。APAP的终浓度为25mM。Triton-X-100的终浓度为1%

　　5.4 培养板在细胞培养箱中，37℃，5%CO2，培养24小时。

　　5.5 去掉上清，然后按照图1，样品组每孔再加入400μL纳米粒子溶液（4.1中配制）。阳性对照组每孔加入400μL APAP溶液（3.5中配制）。阴性对照组每孔加入400μL AM。最大释放组每孔加入400μL 1%Triton（3.4中配制）分别在细胞培养箱中（37℃，5%CO2）孵育24或48小时。

　　5.6 将每孔中的上清液全部（360μL）转移至1.5mL EP管中，室温离心20min，转速大于16000xg。

　　5.7 将上清转移至96孔板中，每管上清分别对应三个平行孔，每孔加100μL。（图2）

　　5.8 每孔加入100μL反应液（见3.6.2）。震荡混匀后，室温避光反应30min。

　　5.9 在酶标仪上读取490nm和680nm（参考波长）处的吸光度，两个吸光度的差值为该孔的测量值（OD）。

图2 96孔板加样图例。样品1-4为不同浓度的样品溶液。APAP的终浓度为25mM。Triton-X-100的终浓度为1%

6.数据分析

　　6.1 变化系数百分比：CV%=SD/mean×100，其中SD为标准偏差，mean为平均值。

　　6.2 LDH释放百分比 LDH%=（样品释放OD-自然释放均值OD）/（最大释放均值OD-自然释放均值）×100%

　　OD=含有细胞的测量值-相应无细胞对照测量值均值

　　自然释放：细胞+400μL AM

　　自然释放对照：400μL AM

　　最大释放：细胞+400μL 1% Triton-X-100

　　最大释放对照：400μL 1% Triton-X-100

　　样品释放：细胞+400μL待测样品或阳性对照（APAP）

　　样品释放对照：400μL待测样品或阳性对照（APAP）

7.接受标准

　　7.1 对于APAP阳性对照组，48小时的细胞活力应小于75%，释放的总LDH%应大于15%。

　　7.2 阳性对照以及样品的CV%应小于50%。

　　7.3 需同时满足7.1和7.2的标准，检测可认为成功。否则，需重新进行检测。

8.缩略语

　　APAP：对乙酰氨基酚

　　CV：变更系数

　　FBS：胎牛血清

　　LDH：乳酸脱氢酶

　　min：分钟

　　PBS：磷酸缓冲盐溶液

9.参考文献

[1]ISO 10993-5 Biological evaluation of medical devices： Part 5 Tests for in vitro cytotoxicity.

[2]F1903-98 Standard Practice for Testing for Biological Responses to Particles in vitro.

[3]Cytotoxic detectionkit（LDH）instruction（#11644793001）,Roche Ltd.

[4]Decker T, Lohmann-Matthes ML. J. Immunol Methids（1988）15:61-69.

[5]Korzeniewski C, Callewaert DM. J. Immunol Methods（1983）64:313-320.

[6]Stem ST, Potter TM. LLC-PK1 kidney cytotoxicity assay. NCL Method（2010）GTA-1（Version 1.1）:1-11.

[7]YY/T 0993-2015,医疗器械生物学评价 纳米材料：体外细胞毒性实验（MTT试验和LDH试验）。

  国家纳米科学中心分析报告