聚合物纳米胶束形貌的透射电子显微镜检测方法

前 言

　　本技术规范按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。

　　为积极响应国务院《深化标准化工作改革方案》中大力培育发展团体标准、扩大标准有效供给的号召，同时也为了尽快将科技成果向标准转化、推动技术进步，为建设新型标准体系贡献力量，特制定本技术规范，以更好发挥标准化在服务支撑经济社会发展中的基础性、战略性作用。现广泛征求相关单位和个人宝贵意见。   

　　本技术规范由中国科学院提出，由国家纳米科学中心起草，旨在为聚合物纳米胶束形貌的透射电子显微镜检测方法提供技术指导。   

　　本技术规范主要起草人：梁兴杰、吴雁、葛广路、张东慧、翁郁华

聚合物纳米胶束形貌的透射电子显微镜检测方法

Method of transmission electron microscopy for polymer nanomicelle morphology identification

　　1 范围   

　　本标准规定了采用透射电子显微镜检测高分子纳米材料的术语和定义、原理、仪器及试剂、检测方法及步骤、结果表示以及检测结果报告。   

　　本标准适用于应用透射电子显微镜进行纳米胶束的形貌及粒度分析。   

　　2 规范性引用文件

　　下列文件为本文件所引用，对本文件的应用必不可缺。凡是注明日期的引用文件，则仅注明日期的版本适用于本文件。凡不注明日期的引用文件，其最新版本（包括最新的修改单）适用于本文件。   

　　GB/T 19619 纳米材料术语

　　3 术语和定义   

　　GB/T 19619确立的以及下列术语和定义适用于本文件。

　　3.1 聚合物纳米胶束   polymeric nanomicelles

　　由双亲性共聚物在选择性溶剂中发生微相分离而形成的具有疏水性内核和亲水性外壳的自组装结构，通常形成纳米级粒径（小于100nm）。

　　3.2 透射电子显微镜法   transmission electron microscopy

　　以透射电子为成像信号，通过电子光学系统的放大成像观察样品的微观组织和形貌的分析技术。   

　　3.3 负染色技术   negative staining technique

　　相对于正染色技术而言。在制备超薄切片、高分子材料等的透射电镜样品时，在染色的过程中，因染色液中某些电子密度高的物质（如重金属盐等）沉积在支持物的表面，营造出黑暗的背景，而样品结构明亮突出，两者之间的反差使得图像对比度得以增加。   

　　3.4 负染色剂   negative staining reagent

　　用于负染色技术使用的试剂，通常为重金属化合物，如醋酸双氧铀，磷钨酸，磷钼酸，钼酸铵等。   

　　4 基本原理

　　透射电子显微术是纳米材料的常用表征手段之一2。透射电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，不同之处在于透射电子显微镜的光源为电子束，透镜为电磁场。透射电子显微镜由照明系统、成像系统、真空系统、记录系统、电源系统及其他附件等部分组成。经加速和聚集的电子束透射到样品时，电子与样品中的原子发生碰撞，因而改变方向产生散射，再经过电子光学系统放大、成像，反映出样品的微观组织和形貌，不同密度、厚度、大小的样品形成明暗不同的影像。

　　负染色技术是制备聚合物胶束透射电镜样品的的关键技术。通常选择具有较高电子密度的重金属盐类作为负染色剂，在负染色过程中，样品与染色液之间不发生化学反应，围绕在样品周围的重金属离子由于密度很高，增强了电子散射的能力，从而在电子密度高的灰黑色背景中反衬出低电子密度的明亮清晰的样品结构。　

　　5 仪器及试剂   

　　5.1 仪器

　　5.1.1 透射电子显微镜

　　包含有照明系统、成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等。   

　　5.1.2 干燥器

　　内装有效充足的干燥剂和一个多孔金属板或瓷板。   

　　5.1.3 烘片机

　　有控制和调节温度的装置，可提供100℃内的恒温。

　　5.2 试剂

　　5.2.1 电镜载网   

　　载网表面覆碳支持膜，孔的目数范围为50-300目。

　　5.2.2 醋酸双氧铀

　　纯度在99%以上。

　　6 检测方法及步骤

　　6.1 检测环境条件

　　温度：15℃～35℃；

　　相对湿度：不大于80%。

　　6.2 样品制备方法

　　6.2.1 聚合物纳米胶束样品先用去离子水稀释，建议浓度范围为0.1mg/mL～2mg/mL，并经室温超声分散，超声功率建议为5～50KHz，超声时间1-20min。

　　6.2.2 取一干净的表面皿，将碳支持膜的载网依次正面向上摆放于皿内，取1-10μL稀释的样品溶液滴加于载网表面，并干燥以除去水分，可放在烘片机上干燥，建议设置温度为30℃～40℃，一般干燥20min～2h；也可置于干燥器中，室温干燥2h～24h。

　　6.2.3 滴加少许负染试剂2%醋酸双氧铀于载网上，滴加量一般为1-10μL，室温避光染色2min～30min，也可用2%磷钨酸作为负染试剂同样操作。对于粒径极小的胶束，可以适当延长负染时间，也可短时、多次操作，如染色1min～2min，除去多余染液，重复染色多次。

　　6.2.4使用滤纸或移液器吸去多余负染试剂，并用去离子水洗涤载网，一般洗涤1～5遍，用以除去过量的负染试剂。具体方法为：吸取1-10μL去离子水滴加在载网上，立即吸走。也可用小镊子夹住载网浸没在去离子水中并立即拿起。   

　　6.2.5 将载网放于烘片机上干燥，建议设置温度为30℃～40℃，一般干燥20min～2h；也可置于干燥器中，室温干燥2h～24h，直至彻底干燥。

　　7 透射电子显微镜检测步骤   

　　7.1 设置加速电压

　　一般推荐为80kV～200kV。

　　7.2 调节成像参数

　　选择亮度、对比度等参数，具体选择应根据透射电镜型号而定。   

　　7.2 安装样品

　　取出样品杆，将载网固定在样品槽上。   

　　7.3 视野的选择

　　在低放大倍数下选择合适的视野，寻找样品集中的区域。   

　　7.4 放大及聚焦　

　　放大至所需的倍数，并聚焦。   

　　7.5 照相并储存图像

　　8 结果表示

　　采取图形和语言描述相结合的方式。   

　　9 检测结果报告

　　检测报告应包括以下信息：   

　　a) 检测报告编号；

　　b）送检样品名称、送检日期和送检目的；

　　c) 送样人姓名，单位，地址，及联系方式；

　　d) 仪器型号、测试方法及条件（加速电压、放大倍数、检测温度）；

　　e) 检测结果和必要的说明（附图片）；

　　f) 测试过程中出现的异常现象；

　　g) 本标准中未明确的操作步骤，可能对分析结果产生的影响；

　　h) 检测报告负责人签名；

　　i) 检测报告的日期；

　　j)   实验室名称及地址。